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分光光度計(jì)的特點(diǎn)與保養(yǎng)維護(hù)
分光光度計(jì)的特點(diǎn)
*的雙光路、雙光束光學(xué)系統(tǒng)，儀器分辨率更高，雜散光更低，穩(wěn)定性、可靠性更強(qiáng)，分析更加準(zhǔn)確采用320*240位點(diǎn)陣式高亮6 ”液晶顯示器，顯示清晰，信息完備*的長光程光路設(shè)計(jì)，使儀器分辨率更高，尤其適合微量測試強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理功能，使測試結(jié)果能得到充分的應(yīng)用，用戶編輯更為簡單快捷
采用懸架式光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)，整體光路獨(dú)立固定在16mm厚的鋁制無變形基座上，底板的變形和外界的震動(dòng)對光學(xué)系統(tǒng)不產(chǎn)生任何影響，從而大大提高了儀器的穩(wěn)定性和可靠性采用同步正弦機(jī)構(gòu)，波長準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好采用ARM系統(tǒng)0.1/0.2/0.5/1.0/2.0/4.0六檔光譜帶寬自動(dòng)可選，滿足不同用戶的測量需求24位高速、高精度A/D轉(zhuǎn)換，儀器精度更高、反應(yīng)速度更快主要元件采用進(jìn)口配置，使儀器雜散光更低、穩(wěn)定性、可靠性更強(qiáng)功能更加強(qiáng)大，主機(jī)可獨(dú)立完成光度測量、定量測量、光譜掃描、動(dòng)力學(xué)、DNA/蛋白質(zhì)測試，多波長測試及數(shù)據(jù)打印等功能充分考慮不同用戶的使用習(xí)慣，本系列儀器都標(biāo)配元析公司光譜掃描軟件，聯(lián)機(jī)操作時(shí)，除能實(shí)現(xiàn)主機(jī)的所有測試功能外，還可實(shí)現(xiàn)更為強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理功能，并且使數(shù)據(jù)存儲達(dá)到無限
■儀器指標(biāo)
型號UV-9000波長范圍190-900nm光譜帶寬0.1/0.2/0.5/1.0/2.0/4.0nm六檔可選波長準(zhǔn)確度±0.1nm（D2 656.1nm）， ±0.3nm全區(qū)域波長重復(fù)性≤0.1nm
光度準(zhǔn)確度
±0.2%T光度重復(fù)性≤0.1%T雜散光≤0.01%T穩(wěn)定性±0.0004A/h（500nm處）基線平直度±0.001A噪聲水平 ±0.0004A/h光度范圍0-200%T、-4.0-4.0A、0-9999C數(shù)據(jù)輸出USB接口光學(xué)系統(tǒng)雙光束、*光柵顯示系統(tǒng)320*240位高亮6"大屏幕LCD光源進(jìn)口長壽命鎢燈、氘燈檢測器*檢測器外形尺寸635*440*210mm電源AC 220V/50Hz或110V/60Hz重量30kg技術(shù)參數(shù)波長范圍：320∽1000nm光譜帶寬：4nm
雜散光：≤0.5%（在360nm處）
波長準(zhǔn)確度：優(yōu)于±2nm
透射比準(zhǔn)確度：≤±1nmT
常見用途
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率zui高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的zui高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。如：1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者zui頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
事實(shí)上，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和度。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng)，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時(shí)，離子濃度太高，也會導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了zui大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值在0.1-1.。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計(jì)的測試范圍）。zui后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的zui小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。
除了核酸濃度，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。
蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm 的“背景”信息，設(shè)定此功能“開”。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，*的線性范圍在1.0-1.5 之間。實(shí)驗(yàn)中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因?yàn)閃arburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
比色法蛋白質(zhì)定量蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的混合物，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。
比色方法
一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。
Lowry 法：以zui早期的Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2 反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑；反應(yīng)需要的時(shí)間較長；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。
BCA（Bicinchoninineacidassay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2 反應(yīng)產(chǎn)生Cu ，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Lowry法，操作簡單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。
Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其zui大的特點(diǎn)是，敏感度好，是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍；操作更簡單，速度更快；只需要一種反應(yīng)試劑；化合物可以穩(wěn)定1小時(shí)，方便結(jié)果；而且與一系列干擾Lowry，BCA 反應(yīng)的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的。zui主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。
某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結(jié)果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一，所以同時(shí)使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller等測試人奶中的蛋白，結(jié)果Lowry，BCA 測出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，是參照要測試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低，導(dǎo)致測出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。關(guān)鍵問題是，反應(yīng)后1011分光光度計(jì)的重要配件—— 比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測試時(shí)間，所有的樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)樣品），都必須在此時(shí)間內(nèi)測試。時(shí)間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應(yīng)溫度、溶液PH值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因。此外，非常重要的是，是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會讓石英或者玻璃著色，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確。
細(xì)菌細(xì)胞密度（OD 600）
實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測推斷細(xì)菌的生長密度。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測定細(xì)菌細(xì)胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，做出校正曲線。實(shí)驗(yàn)中偶爾會出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時(shí)間后，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng)。另外，需要注意的是，測試的樣品不能離心，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài)。
分光光度計(jì)的重要配件—— 比色杯
比色杯按照材質(zhì)大致分為石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根據(jù)不同的測量體積，有比色杯和毛細(xì)比色杯等。一般測試核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測定。因?yàn)榉磻?yīng)中的染料（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃著色，所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內(nèi)測試樣品。
由于另外測試的樣品量不同，所以一般分光光度計(jì)廠家提供不同容積的比色杯以滿足用戶不同的需求。市場已經(jīng)存在一種既可用于核酸、紫外蛋白質(zhì)定量，亦可用于蛋白比色法測定的塑料杯，樣品用量僅需50μl，比色杯單個(gè)無菌包裝，可以回收樣品。如Eppendorf UVette?；塑料比色杯，是比色杯市場上一個(gè)革新。隨著生命科學(xué)以及相關(guān)學(xué)科發(fā)展，對此類科學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究提出更高的要求，分光光度計(jì)將是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室*的儀器，也成為微生物、食品、制藥等相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的*設(shè)備之一。
隨著科技的發(fā)展，比色杯已經(jīng)不是使用分光光度計(jì)時(shí)的*物品。國外Nanodrop公司（現(xiàn)已被Thermo Fisher公司收購）生產(chǎn)的ND1000分光光度計(jì)與舊式分光光度計(jì)相比，已經(jīng)可以做到無需稀釋樣品，無需使用比色杯，每次測量僅需1-2μl樣品即可完成測量。
操作方法
1.接通電源，打開儀器開關(guān)，掀開樣品室暗箱蓋，預(yù)熱10分鐘。
2.將靈敏度開關(guān)調(diào)至“1”檔（若零點(diǎn)調(diào)節(jié)器調(diào)不到“0”時(shí)，需選用較。）
3.根據(jù)所需波長轉(zhuǎn)動(dòng)波長選擇鈕。
4.將空白液及測定液分別倒入比色杯3/4處，用擦鏡紙擦清外壁，放入樣品室內(nèi)，使空白管對準(zhǔn)光路。
5.在暗箱蓋開啟狀態(tài)下調(diào)節(jié)零點(diǎn)調(diào)節(jié)器，使讀數(shù)盤指針指向t=0處。
6.蓋上暗箱蓋，調(diào)節(jié)“100”調(diào)節(jié)器，使空白管的t=100，指針穩(wěn)定后逐步拉出樣品滑竿，分別讀出測定管的光密度值，并記錄。
7.比色完畢，關(guān)上電源，取出比色皿洗凈，樣品室用軟布或軟紙擦凈。
注意事項(xiàng)
1．該儀器應(yīng)放在干燥的房間內(nèi)，使用時(shí)放置在堅(jiān)固平穩(wěn)的工作臺上，室內(nèi)照明不宜太強(qiáng)。熱天時(shí)不能用電扇直接向儀器吹風(fēng)，防止燈泡燈絲發(fā)亮不穩(wěn)定。
2．使用本儀器前，使用者應(yīng)該首先了解本儀器的結(jié)構(gòu)和工作原理，以及各個(gè)操縱旋鈕之功能。在未按通電源之前，應(yīng)該對儀器的安全性能進(jìn)行檢查，電源接線應(yīng)牢固，通電也要良好，各個(gè)調(diào)節(jié)旋鈕的起始位置應(yīng)該正確，然后再按通電源開關(guān)。
3．在儀器尚未接通電源時(shí)，電表指針必須于“0”刻線上，若不是這種情況，則可以用電表上的校正螺絲進(jìn)行調(diào)節(jié)。
日常維護(hù)
分析儀器工作者要懂得儀器的日常維護(hù)和對主要技術(shù)指標(biāo)的簡易測試方法，自己經(jīng)常對儀器進(jìn)行維護(hù)和測試，以保證儀器工作在*狀態(tài)。
一、溫度和濕度是影響儀器性能的重要因素。他們可以引起機(jī)械部件的銹蝕，使金屬鏡面的光潔度下降，引起儀器機(jī)械部分的誤差或性能下降；造成光學(xué)部件如光柵、反射鏡、聚焦鏡等的鋁膜銹蝕，產(chǎn)生光能不足、雜散光、噪聲等，甚至儀器停止工作，從而影響儀器壽命。維護(hù)保養(yǎng)時(shí)應(yīng)定期加以校正。應(yīng)具備四季恒濕的儀器室，配置恒溫設(shè)備，特別是地處南方地區(qū)的實(shí)驗(yàn)室。
二、環(huán)境中的塵埃和腐蝕性氣體亦可以影響機(jī)械系統(tǒng)的靈活性、降低各種限位開關(guān)、按鍵、光電偶合器的可靠性，也是造成必須學(xué)部件鋁膜銹蝕的原因之一。因此必須定期清潔，保障環(huán)境和儀器室內(nèi)衛(wèi)生條件，防塵。
三、儀器使用一定周期后，內(nèi)部會積累一定量的塵埃，由維修工程師或在工程師指導(dǎo)下定期開啟儀器外罩對內(nèi)部進(jìn)行除塵工作，同時(shí)將各發(fā)熱元件的散熱器重新緊固，對光學(xué)盒的密封窗口進(jìn)行清潔，必要時(shí)對光路進(jìn)行校準(zhǔn)，對機(jī)械部分進(jìn)行清潔和必要的潤滑，zui后，恢復(fù)原狀，再進(jìn)行一些必要的檢測、調(diào)校與記錄。
分光光度計(jì)的維護(hù)保養(yǎng)
分光光度計(jì)作為一種精密儀器，在運(yùn)行工作過程中由于工作環(huán)境，操作方法等種種原因，其技術(shù)狀況必然會發(fā)生某些變化，可能影響設(shè)備的性能，甚至誘發(fā)設(shè)備故障及事故。因此，分析工作者必須了解分光光度計(jì)的基本原理和使用說明，并能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和排除這些隱患，對已產(chǎn)生的故障及時(shí)維修才能保證儀器設(shè)備的正常運(yùn)行。
1)若大幅度改變測試波長，需稍等片刻，等燈熱平衡后，重新校正“0”和“100%”點(diǎn)。然后再測量。
2)指針式儀器在未接通電源時(shí)，電表的指針必須位于零刻度上。若不是這種情況，需進(jìn)行機(jī)械調(diào)零。
3)比色皿使用完畢后，請立即用蒸餾水沖洗干凈，并用干凈柔軟的紗布將水跡擦去，以防止表面光潔度被破壞，影響比色皿的透光率。
4)操作人員不應(yīng)輕易動(dòng)燈泡及反光鏡燈，以免影響光效率。
5)1900型等分光光度計(jì)，由于其光電接收裝置為光電倍增管，它本身的特點(diǎn)是放大倍數(shù)大，因而可以用于檢測微弱光電信號，而不能用來檢測強(qiáng)光。否則容易產(chǎn)生信號漂移，靈敏度下降。針對其上述特點(diǎn)，在維修、使用此類儀器時(shí)應(yīng)注意不讓光電倍增管長時(shí)間暴露于光下，因此在預(yù)熱時(shí)，應(yīng)打開比色皿蓋或使用擋光桿，避免長時(shí)間照射使其性能漂移而導(dǎo)致工作不穩(wěn)。
6)放大器靈敏度換擋后，必須重新調(diào)零。
7)比色杯的配套性問題。比色杯必須配套使用，否則將使測試結(jié)果失去意義。在進(jìn)行每次測試前均應(yīng)進(jìn)行比較。具體方法如下；分別向被測的兩只杯子里注入同樣的溶液，把儀器置于某一波長處，石英比色杯；220nm、700nm裝蒸餾水，玻璃比色杯：700nm處裝蒸餾水，將某一個(gè)池的透射比值調(diào)至100%，測量其他各池的透射比值，記錄其示值之差及通光方向，如透射比之差在±0.5%的范圍內(nèi)則可以配套使用，若超出此范圍應(yīng)考慮其對測試結(jié)果的影響。
分光光度計(jì)分操作中容易出現(xiàn)的幾個(gè)典型故障及其排除方法：
1)儀器不能調(diào)零。可能原因：
a)光門不能*關(guān)閉。解決方法：修復(fù)光門部件，使其*關(guān)閉。
b)透過率“100%”旋到底了。解決方法：重新調(diào)整“100%”旋鈕。
c)儀器嚴(yán)重受潮。解決方法：可打開光電管暗盒，用電吹風(fēng)吹上一會兒使其干燥，并更換干燥劑。
d)電路故障。解決方法：送修理部門，檢修電路。
2)儀器不能調(diào)“100%”。可能原因：
a)光能量不夠。解決方法：增加靈敏度倍率檔位，或更換光源燈(盡管燈還亮)。
b)比色皿架未落位。解決方法：調(diào)整比色皿架使其落位。
c)光電轉(zhuǎn)換部分老化。解決方法：更換部件。
d)電路故障。解決方法：調(diào)修電路。
3) 測量過程中，“100%”點(diǎn)經(jīng)常變動(dòng)。可能原因：
a)比色皿在比色皿架中放置的位置不一致，或其表面有液滴。解決方法：用擦鏡紙擦干凈比色皿表面，然后將其安放在比色槽的左邊，上面用定位夾定位。
b)電路故障(電壓、光電接收、放大電路)。解決方法：送修。
4)數(shù)顯不穩(wěn)。可能原因：
a)預(yù)熱時(shí)間不夠。解決方法：延長預(yù)熱時(shí)間至30分鐘左右(部分儀器由于老化等原因，長時(shí)間處于工作狀態(tài)時(shí)，也會工作不穩(wěn))。
b)光電管內(nèi)的干燥劑失效，使微電流放大器受潮。解決方法：烘烤電路，并更換或烘烤干燥劑。
c)環(huán)境振動(dòng)過大、光源附近空氣流速大、外界強(qiáng)光照射等。解決方法：改善工作環(huán)境。
d)光電管、電路等其它原因。解決方法：送修。
五、提高分光光度計(jì)透射比檢定及使用精度的幾種方法
在分光光度計(jì)的使用或檢定中，透射比(吸光度)的準(zhǔn)確度是衡量儀器工作性能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，它的準(zhǔn)確程度直接關(guān)系到所測數(shù)據(jù)的可信性及科學(xué)性。所以提高此項(xiàng)指標(biāo)的使用及檢定準(zhǔn)確度顯得尤為重要。
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